1 - Isolamento Viral
O isolamento viral é o método mais específico (padrão ouro) para o isolamento e a identificação do sorotipo do DENV responsável pela infecção. Pode ser realizada em amostras de sangue total, líquido céfalo-raquidiano (LCR) e fragmentos de vísceras (fígado, baço, coração, pulmão, rim e cérebro).
Para a identificação viral utiliza-se a cultura de células e a técnica de imunofluorescência, que se baseia na reação de um anticorpo marcado com um fluorocromo ( anticorpos fluorescentes) com o seu antígeno homólogo. A coleta de espécimes biológicos para a tentativa de isolamento viral deverá ser orientada pela vigilância epidemiológica de cada município, respeitando o território e a capacidade dos laboratórios de referência.
A colheita da amostra deverá ser feita até NO MÁXIMO o 5º dia de viremia, dando PRIORIDADE aos pacientes que estejam até no 3º dia de início de sintomas e que tenha resultado positivo de NS1( teste rápido para dengue). No caso de óbito, sangue e fragmentos de vísceras (preferencialmente fígado, baço, linfonodos, etc.) deverão ser obtidos e submetidos sob refrigeração.
Devido ao custo do exame de isolamento viral, o mesmo deverá caracterizar com qualidade, quantidade e distribuição o sorotipo circulante e com todos os cuidados acima descritos, devendo os espécimes ser coletados em serviços de saúde que definiremos abaixo como Unidades Sentinelas.
As unidades definidas como sentinelas são: Hospitais Regionais situados nas cidades de: Pau dos Ferros, Mossoró, Currais Novos, João Câmara, Santa Cruz, São José de Mipibú e os localizados na Capital. Na capital também são considerados sentinelas o Hospital Infantil Varela Santiago, O Hospital Unimed e os Prontos Atendimentos referidos no Plano de Contingência do município do Natal. Cada Unidade sentinela deverá coletar um mínimo de 5 coletas mês e no máximo 20.
Os pacientes elegíveis para coleta: são pessoas com doença febril aguda, que estejam no máximo até no quinto dia de início de sintomas e que apresente mais dois dos seguintes sintomas ou sinais: cefaléia, dor retro orbitária, mialgia ou artralgia, erupção cutânea, manifestações hemorrágicas ou leucopenia e que tenham amostra de NS1positivo.
No caso de óbito, puncionar o sangue direto do coração e encaminhar ao LACEN nas condições de acondicionamento e transporte abaixo referidos. Sempre que possível, deve ser obtido fragmentos de vísceras para os exames visando isolamento viral. Os espécimes devem ser conservados sob refrigeração.
RECOMENDAÇÕES DO SETOR DE VIROLOGIA DO LACEN – RN QUANTO A IDENTIFICAÇÃO, COLETA, CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE DE AM OSTRAS DE SANGUE TOTAL DESTINADAS AO ISOLAMENTO VIRAL DO DENGUE
OBJETIVO: fazer tentativa de isolamento viral para detectar precocemente os sorotipos circulantes do Vírus Dengue, bem com os casos de infecção pelo Vírus da Febre Amarela em amostras de sangue total. Sendo a indicação do procedimento orientada pela vigilância epidemiológica de cada município.
MÉTODO: Cultivo celular do material em linhagem contínua clone C6/36 (originária de células embrionárias de Aedes albopictus).
IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA: Identificar o tubo (plástico de preferência tipo KMA estéril e com tampa de rosca) com nome completo do paciente e a data da coleta. Usar lápis tipo piloto tinta permanente ou rótulo que não descole ou desbote ao contato com o congelamento. A amostra obrigatoriamente deverá vir acompanhada da Ficha de Investigação de Dengue do SINAN, devidamente preenchida, contendo todos os dados solicitados do paciente e Unidade Notificadora.
TIPO DE AMOSTRA: SANGUE TOTAL SEM ANTICOAGULANTE. Colher o sangue diretamente em tubo estéril, sem anticoagulante e sem qualquer aditivo (1 a 3 ml). Não encher totalmente o tubo (deixar espaço entre o sangue e a tampa). Os tubos deverão ser: de plástico, esterilizados, com tampa de rosca (tipo tubo criogênico, rosca externa, vol. 2 ou 5 ml ou tubo de plástico à vácuo, sem aditivo cap. 5ml), devidamente tampado e identificado. Na coleta com seringa o sangue deverá ser transferido para o tubo, imediatamente após a punção e levado imediatamente para o congelamento.
PERÍODO DA COLETA: do 1º ao 5º dia a partir do início dos sintomas.
VOLUME DA AMOSTRA: de 1 a 3 ml de sangue total.
CONSERVAÇÃO: Imediatamente após a coleta (não deixar coagular), conservar a amostra sob congelamento (em congelador,freezer -20°C ou freezer -70ºC) e transportar ao LACEN – RN , no prazo máximo de 1 semana.
TRANSPORTE: Colocar o tubo em saco plástico e acondicioná-lo em isopor ou caixa térmica, com gelo seco(de preferência), gelo reciclável ou gelo comum. Não se esquecer de enviar a Ficha de Investigação do SINAN e a requisição médica. Conduzir ao LACEN-RN em até 6 horas.
* AMOSTRAS QUE NÃO ATENDEREM ESTES REQUISITOS NÃO SERÃO PROCESSADAS.
* O SUCESSO DO ISOLAMENTO VIRAL DEPENDE DIRETAMENTE DO CUMPRIMENTO DESTES REQUISITOS.
* O LACEN –RN NO MOMENTO SÓ ESTÁ REALIZANDO O ISOLAMENTO VIRAL DO DENGUE EM AMOSTRAS DE SANGUE TOTAL. CONTINUAMOS A ENVIAR AO INSTITUTO EVANDRO CHAGAS AS DEMAIS AMOSTRAS.
Tipo de Amostra: Fragmentos de Vísceras e Órgãos
Nos casos de óbito, o diagnóstico pode e deve ser confirmado a partir de fragmentos de tecidos de fígado, baço, pulmão e gânglios linfáticos. Recomenda-se a obtenção de fragmentos destes tecidos e, quando possível, também do cérebro (para diagnóstico de outras arboviroses), mediante necropsia. Outra alternativa é a obtenção destes tecidos (de preferência fígado e baço) usando viscerótomo ou qualquer agulha grossa e comprida, como as usadas para realização de biopsia de fígado, pleura, rim etc.
Os tecidos são fontes alternativas de isolamento viral. Estes deverão ser coletados tão cedo quanto possível após a morte, preferencialmente dentro das primeiras seis horas. Passadas doze ou mais horas após a morte, o exame torna-se cada vez mais difícil. Com vinte e quatro horas após a morte é quase impossível ter sucesso, devido a autólise e degradação do tecido, exceto em casos muito especiais. Mesmo assim é interessante que a amostra de tecido seja obtida e enviada (informar as condições de coleta) embora as possibilidades de êxito sejam menores.
Fragmentos de pelo menos 1 cm3 devem ser obtidos e colocados em frasco estéril com tampa rosca em duas amostras acondicionadas a temperatura de -70ºC (quando possível) e com o preenchimento dos dados do paciente no formulário de requisição de exames já referido anteriormente. É importante rotular a amostra e usar um frasco para cada tipo de órgão ou tecido. O ideal é que estes procedimentos destinados ao isolamento viral do dengue, sejam realizados desde o início em condições de esterilidade , sob refrigeração e de imediato submetidos a congelamento -20ºC ou -70ºC ( preferencialmente).
2 - Sorologia
A sorologia é um método laboratorial que serve como meio alternativo de diagnóstico. Existem várias técnicas que podem ser utilizadas no diagnóstico sorológico do vírus do Dengue, incluindo os de inibição de hemaglutinação (HI), fixação de complemento (FC), neutralização (N) e ELISA de captura de IgM (MAC-ELISA). Os três primeiros exigem amostras pareadas de soro de casos suspeitos, e a confirmação é demorada. O MAC-ELISA é o exame mais útil para vigilância, porque requer somente uma amostra de soro na maioria dos casos, e o exame é simples e rápido no entanto no Rio Grande do Norte e outros estados do pais tem sido muito difícil a confirmação dos casos, pois as reinfecções tem contribuído para a não detecção de IgM, pois nas infecções secundárias a produção de anticorpos IgM é rápida (precoce) e fugaz (baixa quantidade).
Baseia-se na detecção de anticorpos IgM específicos aos 4 sorotipos do vírus do Dengue. O anticorpo IgM anti-Dengue se desenvolve rapidamente; em torno do quinto dia do início da doença, na maioria dos casos, principalmente nas primoinfecções; quanto às reinfecções (infecções secundárias), a produção baixa de IgM dificulta a detecção desse anticorpo o que pode resultar em resultado falso negativo. A confiabilidade dos resultados dos testes laboratoriais depende do cuidado durante a coleta, manuseio, acondicionamento e envio de amostras. Depois da retração do coágulo, centrifugar a 1.500 rpm por 10 minutos, para separar o soro.
Tipo de Amostra: Soro
O sangue deve ser colhido a partir do 5º dia do início dos sintomas e até no máximo o 30º. Se a primeira amostra colhida for negativa e não existir critérios para encerramento do caso por vínculo epidemiológico, uma segunda deverá ser obtida uma ou duas semanas após a colheita da primeira.
Coletar 5 ml de sangue sem anticoagulante, colocar em tubo estéril e fechar, esperar a retração do coagulo e centrifugar a 1.500 RPM por 10 minutos, para separar o soro. Acondicionar o soro em tubo plástico estéril com tampa de rosca devidamente identificado e conservar em freezer a - 20ºC. Colocar a amostra em saco plástico e transportar de acordo com o fluxo estabelecido pelo município em CAIXA TÉRMICA com gelo comum ou reciclável. O material deverá ser acompanhado da ficha de investigação do SINAN devidamente preenchida em todos os seus campos. Em epidemias, a sorologia deve ser colhida em casos suspeitos iniciais e mantida uma amostragem de 10 a 30% para acompanhamento da curva epidêmica da doença. É importante fazer o mapeamento dos casos por ruas, bairros, localidades a fim de se conhecer a concentração destes, otimizar os recursos nas ações de controle e estabelecer uma amostragem representativa da população atingida. Todas as pessoas com suspeita de Febre hemorrágica do Dengue devem colher amostra de sangue para sorologia ou para isolamento viral se estiver no início da doença.
Antes do envio ao laboratório manter as amostras no congelador ou no freezer a –20º C. Identificar corretamente e não transportar os frascos em contato direto com o gelo para, se esse derreter, não danificar o rótulo com a identificação da amostra. As amostras Para sorologias é importante que sejam acondicionadas por no máximo uma semana até o seu envio ao LACEN.
3 - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) técnica de biologia molecular utilizada com sucesso para a detecção do ácido nucléico pelo método da Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), não é utilizada na rotina, entretanto pode ser utilizada para os casos onde os ous todos foram insuficientes para esclarecer a suspeita clinico epidemiológica, especialmente nos casos graves e ou nos que evoluíram para o óbito.
Os materiais utilizados são soro, sangue, líquido céfalo-raquidiano(LCR) dos pacientes suspeitos, culturas de células de mosquitos infectados com vírus Dengue e larvas de mosquitos, bem como em amostras de tecidos de casos fatais. O Soro para PCR deve ser colhido até no máximo o 5º dia de início dos sintomas e acondicionado a -70º com todos os cuidados de transporte e preenchimento das fichas já referidas neste documento.
4 - Detecção de Antígenos NS1 método imunoenzimático (Elisa) que permite a detecção de antígenos virais específicos de sangue do tipo NS1. É um método, a princípio, muito sensível e específico, devendo ser utilizado devido ao custo nas unidades sentinelas orientando as amostras de isolamento viral e também nos casos internados para orientação melhor da hipótese diagnóstica e consequentemente contribuir na conduta do médico. Portanto, os espécimes (soro, sangue, LCR, fragmentos de vísceras, mosquitos, etc.) devem colhidos e preservados de modo semelhante para as tentativas de isolamento viral e de biologia molecular para RT-PCR.
5 - Diagnóstico Histopatológico diagnóstico presuntivo realizado em material obtido após a morte do paciente. As lesões anatomopatológicas devem ser investigadas no fígado, baço, coração, linfonodos, pulmões, rins e cérebro.
6 - Imunohistoquimica - método de diagnóstico complementar específico que tem como objetivo a detecção de antígenos virais em cortes de tecidos fixados em formalina tamponada e emblocados em parafina, corados pela fosfatase alcalina ou peroxidase marcada com anticorpo específico. Esta técnica é bastante sensível e específica sendo considerada exame confirmatório, e deve ser utilizada após o diagnóstico histopatológico presuntivo.
Para a realização deste exame o material coletado são pequenos fragmentos ( 1 a 2 cm ) de fígado, baço, pulmão, linfonodo, e cérebro até 24 horas após o óbito.
Colocar os fragmentos de vísceras em frascos estéreis com tampas de rosca e transparentes contendo formalina tamponada a 10%, com volume 10 vezes maior que o volume dos fragmentos. Conservar o material sempre à temperatura ambiente e encaminhar em caixa térmica sem gelo para LACEN. Ter o mesmo cuidado de rotular corretamente e separar conforme citado anteriormente e encaminhar uma ficha do SINAN com as informações do paciente e do quadro de doença.
Recomenda-se a leitura e divulgação deste documento para todos os serviços de saúde, como também a leitura do anexo VIII das Diretrizes Nacionais para a Prevenção e Controle de Epidemias de Dengue Brasilia/DF.2009.
Em caso de dúvidas, entrar em contato com a Dra. Francisca, Carmélia e Edilza- 3232-6202.LACEN - 3232.6202, lacen@rn.gov.br, ou com a Coordenação do Programa Estadual de Controle do Dengue pelo telefone - 3232.2598 ou pelo e-mail endemiasrn@gmail.com
